病原體循環標志物的檢測對于疾病的診斷和治療監控意義重大，但由于免疫復合物導致的屏蔽作用，以及不同病原體蛋白質與抗體間的的交叉反應，傳統免疫測定法的靈敏度和特異性較差。

通過質譜方法對標志物蛋白中序列特異的多肽檢測可以很好地解決上述問題，甚至是對由于微小序列突變蛋白，或者是不同亞型細菌/病毒引發的疾病進行分型。然而，質譜檢測需要相對昂貴的設備和熟練的技術人員，因此不利于在傳染病經常流行且資源有限的發展中地區廣泛推廣。

為了解決這些問題，來自杜蘭大學的胡曄教授課題組致力于尋求使用納米孔作為質譜的經濟替代技術的可能性，并將該技術用于臨床樣本中多肽生物標志物的精準識別和檢測。

基于納米孔的傳感器可以在特定的施加電壓、pH和鹽濃度產生特征離子電流，并且該信號會在特定分子的相互作用產生非常敏感和特異的信號變化，從而形成對應于特定靶標特異的特征譜。這種原理已經在核酸檢測和測序中被廣泛應用。

最近的研究表明，由肽-納米孔相互作用產生的特征信號實現多肽標準品的精準鑒定。然而，由于臨床樣本成分的復雜性，基于納米孔的多肽傳感器在臨床實際應用中的可行性仍有待探索。

為了填補基礎研究和臨床納米孔應用之間的這一空白，近期，胡曄團隊在Nano Today上發表了文章“Nanopore-based disease diagnosis using pathogen-derived tryptic peptides from serum“，開發了一種方法實現實際樣品中與疾病相關多肽的檢測。

首先，研究人員運用理化性質分析預測出高度抗原性的多肽序列，這種序列的多肽不僅和疾病高度相關，還可以與納米孔相互作用產生特異性的信號。

其次，研究人員進一步篩選純化出對該多肽具有高度親和力的單克隆抗體。通過對血清樣本進行簡單的胰蛋白酶消化處理，該抗體便可以通過免疫沉淀的過程在血清樣本中高效的富集、純化和回收靶標多肽。

最后，研究人員利用定制的算法對靶標多肽與納米孔相互作用產生的電信號進行鑒定和統計學分析，并且確定了具有特定的峰值電流和滯留時間的高度獨特的特征信號譜，實現了在寬的線性范圍內對靶標多肽的檢測。

多肽分析結合免疫純化技術實現納米孔在臨床疾病診斷中的應用

此外，研究人員還進一步研究了幾種可能影響納米孔傳感器開發的主要臨床干擾物，并優化了樣品制備步驟以去除這些干擾物對測量的影響。以結核病為例，研究人員證明該方法可以將來自肺結核病人的血清與來自非疾病的血清對照，以及可以將在長時間抗結核治療后的病例區分開來。

該方法僅需要膜片鉗記錄裝置（用于納米孔的設備），以及用于血液樣本采集和臨床分離的常規臨床實驗室設備。然而，該方法的樣品前處理仍然需要一些人工操作，所以離實現高通量還有一定距離。該研究團隊目前正在開發樣品制備和前處理的自動化裝置，以便于進行大型臨床應用驗證，并致力于進一步開發小型化便攜式納米孔傳感器。

總體而言，該種檢測方法具有很好的普適性，可以很容易地應用于生物標志物的檢測，從而實現傳染病和慢性疾病的診斷和治療監控。

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來源 | IVD分享庫

資料來源 | 微流控、Nano Today

編輯 | 丁小雅 

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